CRISPR-Cas9是一種常用的基因編輯技術，可以用來改造細胞。被改造的細胞有希望應用于各類疾病的治療。細胞治療項目需要通過支原體檢測，才有可能被用于臨床。德國MB支原體qPCR檢測試劑盒，通過歐洲藥典和日本藥典的方法學驗證。

表達轉基因T細胞受體(tcr)或嵌合抗原受體(CARs)的T細胞，已成為一些惡性腫瘤的有效治療選擇。然而，T細胞功能可因慢性刺激而失效。慢性刺激的T細胞可以分化為功能失調狀態，其特征是抑制受體(如PD-1, LAG-3和TIM-3)的表達，增殖和細胞因子的產生減少，轉錄組和染色質景觀改變。以衰竭為特征的T細胞功能障礙已被確定為治療反應不良的主要原因因此，在包括慢性刺激和強直信號在內的環境中，改善治療性T細胞的適應性是改善臨床反應的一個有希望的策略。

基因組工程的進步提供了許多增加T細胞適應性的方法。

一種方法是在內源性TCR α常數(TRAC)鏈13的啟動子調控下，通過靶向CAR整合或篩選共刺激結構域來確定有利的CAR設計來調節CAR調節/信號轉導。

第二種方法使用CRISPR-Cas9去除限制持久T細胞功能的基因。從pd -1開始，crispr - cas9介導的抑制受體敲除(KO)已經在臨床試驗中進行了嘗試功能喪失篩選繼續指出了增加T細胞適應性的擾動，如Regnase-1和/或Roquin，Ptpn2，SOCS1，或rasa2。

作為第三種方法，使用CRISPR激活(CRISPRa)25或開放閱讀框(orf)的慢病毒文庫進行的功能獲得篩選，已經揭示了其可能性，如淋巴蛋白β受體(LTBR)的過表達。然而，這些功能獲得篩選方法并沒有在原代人T細胞中大規模地與抗原特異性tcr或car結合，而且CRISPRa篩選不能測試合成的基因產物。

一種很有前景的方法是通過直接調節轉錄調節因子或通過合成表面受體(SRs)改變細胞對外部信號的反應來設計TCR-/CAR-T細胞的狀態。例如，過表達AP-1/ATF轉錄因子(tf) c-Jun或BATF可以改善CAR-T細胞功能。許多研究小組設計了編碼“開關"受體的合成基因，通過將抑制受體的結構域(如PD-1)融合到激活結構域(如CD28)，將抑制信號轉化為激活信號。包括CD200R/CD28和TIM-3/CD28在內的一系列合成受體已經被開發出來，但需要系統的分析來了解控制哪些結構域配對有效的規則。更廣泛地說，需要一種模塊化篩選方法來發現可以與特定tcr /CARs結合的tf或sr的組合，以提高功能性能。

靶向crispr介導的敲入蛋白(KI)篩選不僅允許在特定位點上測試構建體，而且還克服了匯集的lenti /逆轉錄病毒篩選方法的幾個局限性:病毒重組、半隨機整合和可變整合數。研究人員之前開發了一個非病毒池KI (PoKI)平臺，并篩選了一個包含36個成員的庫，結合ny - eso -1特異性tcr。然而，由于模板切換導致的大量條形碼/構建錯配阻礙了該方法的擴展，這限制了庫的大小和適應性。

近日，科研人員開發了模塊化池KI篩選(ModPoKI)，這是一個使用條形碼多順子適配器模塊化構建DNA KI庫的適應性平臺。相關研究發表在《Cell》上，文章標題為：“Modular pooled discovery of synthetic knockin sequences to program durable cell therapies"。

研究人員構建了兩個ModPoKI文庫，包含100個轉錄因子(tf)和129個天然和合成表面受體(SRs)。在不同條件下對人類TCR-和CAR-T細胞進行了30多次ModPoKI篩選，發現了一種轉錄因子AP4 (TFAP4)結構，該結構在體外和體內增強了慢性刺激CAR-T細胞的適應性和抗癌功能。ModPoKI的模塊化使我們能夠生成一個約10,000個成員的TF組合庫。BATF-TFAP4多順反電子結構的非病毒KI增強了適應度。過表達的BATF和TFAP4共同占據并調控關鍵基因靶點，重編程T細胞功能。ModPoKI有助于發現復雜的基因結構來編程細胞功能。總的來說，這些研究強調了大規模ModPoKI篩選是一種強大的方法，可以加速細胞狀態的編程，增強持久性和治療功能。