梭菌顯色培養(yǎng)基（膜過濾法）

M-CP Agar Base

應(yīng)用

用于歐盟指導(dǎo)委員會(huì)推薦的對(duì)水樣中產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離和計(jì)數(shù)（采用膜過濾法）（3）

背景

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性芽孢桿菌，是人畜共患病原菌，也是人畜腸道正常菌群，它廣泛存在于自然環(huán)境如土壤、糞便和污水中（1）。產(chǎn)氣莢膜梭菌分為五個(gè)亞型，其中一些亞型能分泌外毒素。產(chǎn)氣莢膜梭菌作為條件致病菌，可導(dǎo)致水和食品污染，引發(fā)畜禽和人類疾病，如壞死性腸炎、腹瀉、腸毒血癥、氣性壞疽和食物中毒

有報(bào)道指出，大腸菌群作為水質(zhì)微生物學(xué)指標(biāo)是不可靠的，而產(chǎn)氣莢膜梭菌可作為一個(gè)水污染的指示菌。歐洲已將其作為水質(zhì)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充條款，WHO已在水質(zhì)檢測(cè)中將其作為水質(zhì)污染的微生物。產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量與水污染程度有一定的相關(guān)關(guān)系。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》GB8538—2016規(guī)定，天然礦泉水產(chǎn)品和水源水需檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌。

目前，檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌多采用培養(yǎng)基法和PCR法。實(shí)踐證明，采用快速膜過濾技術(shù)和顯色培養(yǎng)基(mCP培養(yǎng)基），簡單、易行、可靠。

原理

M-CP平板是根據(jù)Armon和Payment的配方而成（2）。培養(yǎng)基中的胰蛋白?、酵母粉提供氮源營養(yǎng)，蔗糖提供碳源營養(yǎng)。溴甲酚紫為pH指示劑。吲哚β-D-葡萄糖苷為β-D-葡糖苷酶或纖維二糖酶的顯色底物，二磷酸酚酞用于檢測(cè)酸性磷酸化酶。添加的D-環(huán)絲氨酸和多粘菌素B（FD153）抑制伴隨的其他菌群。厭氧環(huán)境也提供了進(jìn)一步的選擇性。當(dāng)黃色（纖維二糖酶陰性）菌落在暴露于氨煙30秒后變?yōu)槊倒寮t時(shí)，即可認(rèn)為是產(chǎn)氣莢膜梭菌。顏色鑒別有時(shí)是困難的，因此，可挑取典型菌落（黃變粉色）和非典型菌落（綠色或沒變色）進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可通過硫還原、革蘭氏陽性、芽孢桿狀、無動(dòng)力性、硝還原、明膠液化、乳糖發(fā)酵和其他生化試驗(yàn)證實(shí)（4）。

培養(yǎng)基組分

終pH值為7.6±0.2（25℃）

配制

35.6g干粉溶485ml蒸餾水。加熱煮沸使培養(yǎng)基全溶。15磅121℃高壓滅菌15分鐘。冷卻至45-50℃。用5ml無菌蒸餾水溶解添加劑1（貨號(hào)：FD153），用10ml無菌蒸餾水溶解改良的添加劑2（貨號(hào)：FD154A），將添加劑2（貨號(hào)：FD154）室溫孵育。在485ml無菌溶解冷卻的梭菌顯色培養(yǎng)基溶液中，無菌加入1管添加劑1（貨號(hào)：FD153），1管添加劑2（貨號(hào)：FD154）或改良的添加劑2（貨號(hào)：FD154A），混勻，倒入無菌平皿。

質(zhì)量控制

外觀：淡黃至淡綠色松散粉末。

成膠性：牢固，與1.5％瓊脂凝膠相當(dāng)。

成品顏色和透明度：紫色透明至輕微不透明凝膠。

pH值：7.40-7.80

培養(yǎng)反應(yīng)：在無氧條件下加入添加劑后，43-45℃孵育18-24小時(shí)，觀察接種反應(yīng)。

暴露于氨煙30秒后菌落變?yōu)榘得倒迳恋奂t色。

儲(chǔ)存

2--8℃

參考文獻(xiàn)
1. Czeczulin J. R., Hanna P. C., Mcclane B. A., 1993, Infect. Immun., 61: 3429-3439.

2. Armon R. and Payment P., 1988, Can. J. Microbiol., 34:78-79.

3. Directive of the Council of the European Union 98/83/EC

4. Sartory D. P., Field M., Curbishley S. M., Pritchard A. M., 1998, Lett. Appl. Microbiol., 27:323-327.

產(chǎn)品引用文獻(xiàn)

1. Kadam, A.M., et al., Pathogen removal from municipal wastewater in constructed soil filter.Ecological Engineering, 2008. 33(1): p. 37‐44.

2. Raed S. Al‐Wasify, A.‐S.A. Al‐Sayed, and M.M. Kamel, Sensitivity and Specificity of Chromogenic Media for Detection of Some Pathogens in Water. International Journal of Environment and Sustainability, 2013. 2(1): p. 1‐9.